Práctica 9: Estreptolisina

OBJETIVO

La estreptolisina (SLO) es un purificado procedente del cultivo de Estreptococos β-hemoliticos. Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativo del título de antiestreptolisina O, por la técnica de inhibición de la hemólisis.

FUNDAMENTO

El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos ant-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir

REACTIVO

Kit para 30 det. macro/250 micro. Contiene:

·         10 x 15 ml. Estreptolisina O liofilizada.

·         Prereducida antes de liofilizar. El producto está estandarizado frente al patrón internacional de la O.M.S. de tal manera que 0,5 ml se combinan con 1 unidad internacional de antiestreptolisina.

Opcionalmente:

·         1 x 100 ml Tampón fosfato isotónico pH 6,5.

·         10 veces concentrado. Diluir con agua desionizada hasta obtener 1 litro de disolución.

REACTIVO DE TRABAJO

Rehidratar el vial de Estreptolisina O, liofilizada con el volumen de agua desionizada indicado en la etiqueta. Mezclar suavemente evitando los movimientos enérgicos que podrían conducir a la oxidación del producto. El olor característico de la disolución es debido a la presencia de un reductor. Se recomienda proceder a la hidratación del vial justo antes de la determinación.

MUESTRA

·         Suero fresco. Mantener en refrigerador a 2º-8ºC, no más de 5 días.

PROCEDIMIENTO

MACROMETODO

·         Suspensión de hematíes: sangre total de conejo, humana del grupo 0 o del propio paciente. Se lavará esta sangre 3 veces por centrifugación a 2000 rpm/3-5 min, descartando el sobrenadante. El último centrifugado será de 15 min. Sangres que tras el cuarto lavado, presenten indicios de hemólisis en el sobrenadante, deberán ser desechadas. Como disolución de lavado se recomienda el tampón de fosfato isotónico pH 6,5. Del paquete globular de la última centrifugación se toman 5 ml que se suspenden con 95 ml de la disolución de tampón de fosfato.

·         Diluciones del suero.

Las siguientes diluciones del suero del paciente se preparan:

A.      0,5 ml de suero à        +4,5 ml de tampón  (1:10)

B.      1,0 ml dil. A    à            +9,0 ml de tampón  (1:100)

C.      2,0 ml dil. B  à           +8,0 ml de tampón  (1:500)

 

Se utiliza una batería de tubos como se indica a continuación y se prepara las diluciones que se especifican:

MICROMETODO

·         Suspensión de hematíes. Procede del mismo modo que en el Macrométodo. Tomar el último paquete globular 3 ml y suspenderlos con 97 ml de disolución de tampón fosfato pH 6,5.

·         Diluciones del suero.

Las siguientes diluciones del suero del paciente se preparan:

A.      0,2 ml suero + 1,8 ml tampón  (1:10)

B.      0,1 ml suero + 2,4 ml tampón  (1:25)

Se dispensan 50 μL de tampón en cada pocillo de dos filas de la placa. (Cada suero precisa de dos filas).

1.       Añadimos 50 μL de la dilución  1:10 al primer pocillo de la fila A.

2.       Añadimos 50 μL de la dilución 1:25 al primer pocillo de la fila B.

3.       A partir del primer pocillo efectuamos sucesivas diluciones con la ayuda de un microdiluidor, por pases de 50μL (dejar el último pocillo de cada fila para control)

4.       Añadimos 25μL de disolución de estreptolisina O rehidratada a todos los pocillos excepto en el último de la fila B

5.       Agitamos suavemente e incubar a 15 min/37ºC

6.       Añadimos 25μL de suspensión de hematíes al 3% a cada pocillo.

7.       Agitamos suavemente e incubar 45 min/37ºC, agitando después de los primeros 15min.

8.       Centrifugamos a 1000-1500 rpm/2 min o dejar sedimentar duran unos 50-60 min a temperatura ambiente.

Controles

·         Hematíes: 25μL tampón + 25μL de suspensión de hematíes 3% (fila B).

·         Estreptolisina O: 25μL de SLO + 25μL de suspensión de hematíes al 3% (fila A).