Práctica 6: Antígenos bacterianos

OBJETIVO

Determinar cualitativamente  anticuerpos febriles

FUNDAMENTO

 Los Antígenos Bacterianos son una técnica de aglutinación en porta y tubo para la detección y semicuantificación de anticuerpos anti-Salmonella, Brucella y Proteus en suero humano. Los reactivos, suspensiones bacterianas, coloreadas y estandarizadas, aglutinan en presencia del anticuerpo homologo si los hubiera en la muestra.

UTILIDAD CLÍNICA

El diagnóstico de enfermedades febriles puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre, orina o heces o por la demostración del título de anticuerpos específicos, somáticos (O) y flagelares (H) en el suero del paciente. La determinación de estos anticuerpos forma las bases para el ensayo de Widal que establece que altos niveles de anticuerpos O y H superiores a 1/100 en suero, es indicativo de infección por estos microorganismos.

MATERIAL

·         Tubos de ensayo de 3 ml

·         Gradilla

·         Micropipetas

·         Puntas de pipeta

·         Estufa

·         SSF

REACTIVOS

 

·         Salmonella parataphy AH (flagelar)

·         Control +

·         Control -

·         Kit de Ag febriles

PROCEDIMIENTO

 

Método de aglutinación en porta (cualitativo)

1.       Dejamos atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.

2.       Depositamos 50 µL de la muestra a ensayar (Nota 1 y 2) y 1 gota (50 µL) de cada control en círculos separados de un porta.

3.       Mezclamos el reactivo vigorosamente con el agitador vortex antes del ensayo.

4.       Añadimos una gota (50 µL) de antígeno próxima a la muestra a ensayar.

5.       Mezclamos con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.

6.       Situamos el porta sobre un agitador rotatorio a 80-100 r.p.m., durante 1 minuto.

 

Método de aglutinación en porta (titulación)

1.       Utilizando una micropipeta, dispensamos 80, 40, 20, 10 y 5 µL de muestra no diluida en círculos separados de un porta.

2.       Depositamos 50 µL de antígeno en cada círculo próximo a la muestra a ensayar.

3.       Mezclamos con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.

4.       Situamos el porta sobre un agitador rotatorio a 80-100 r.p.m., durante 1 minuto.

Método de aglutinación en tubo(semicuantificación)

1.       Preparamos una serie de tubos tal como sigue:

 

2.       Preparamos 2 tubos más para Control Positivo y Negativo: 0,1 mL Control + 0,9 mL ClNa 9 g/L.

3.       Añadimos una gota (50µL) de antígeno a cada tubo.

4.       Agitamos e incubamos los tubos a 37ºC durante 24 h (Nota 3).

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Método de aglutinación en porta

Examinamos macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de retirar el porta del agitador y comparamos los resultados con los sueros control.

 Los resultados obtenidos en el método de titulación en porta, son aproximadamente equivalentes a los que se obtendrían en el método de aglutinación en tubo con diluciones del suero de 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320 respectivamente. Cualquier resultado positivo, es aconsejable confirmar el título mediante el método de aglutinación en tubo.

Método de aglutinación en tubo

Examinamos macroscópicamente el modelo de aglutinación y comparamos los resultados con los obtenidos en los tubos control.

 El control positivo debe mostrar aglutinación parcial o completa. El Control negativo no debe mostrar ningún tipo de aglutinación. Se considera como resultado positivo cualquier grado de aglutinación parcial o completa, con diversos grados de clarificación del sobrenadante. El título de la muestra se define como la dilución mayor que muestra resultado positivo.