Práctica 10: Procedimiento de ouchterlony

OBJETIVOS

Introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchterlony

REACTIVOS

·         A Antisuero (Anticuerpo)

·         B Suero total (Antígeno)

·         Albúmina (Antígeno

·         D IgG (Antígeno)

·         E Tampón en polvo

·         1 Agarosa UltraSpec

MATERIAL

·         Tubos Microtest

·         Pipetas de transferencia

·         Plantilla para corte de pocillos (en el protocolo)

·         Cortadores para pocillos (“well cutters”)

·         Placas de Petri

·         Envase de plástico o placa Pyrex

·         Baño de agua

·         Micropipetas automáticas y puntas

·         Baño de agua

·         Espátula o mondadientes

·         Agua destilada

·         Pipetas (5 o 10 ml)

·         Rotulador

·         Microondas

·         Toallas de papel

·         Envoltura o lámina de plástico (film transparente)

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE AGAROSA.

 

1. En un matraz o vaso de precipitados de 500 ml, agregar todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 ml de agua destilada. Agite el matraz o vaso de precipitados para disolver totalmente el polvo

2. Añadir todo el contenido del paquete de Agarosa™ UltraSpec al matraz o vaso de precipitados (3 gr). Agitar la suspensión para dispersar los grumos. Con un rotulador, indicar el nivel de volumen de la solución en el exterior del matraz o vaso de precipitado

3. Se debe calentar (hasta punto de ebullición) la solución para disolver la agarosa. Esto se puede lograr con una placa calefactora. Cubrir el vaso con papel de aluminio. Calentar la mezcla hasta que llegue a punto de ebullición sobre una placa con agitación ocasional. Usar gafas de seguridad y guantes protectores para el calor. Mantener la mezcla con calor hasta que toda la agarosa gelatinosa se disuelva. Durante el calentamiento, retirar ocasionalmente el vaso de precipitados del calor y verificar que no haya partículas pequeñas y claras de agarosa. Continuar calentando con agitación ocasional. La solución final debe ser clara y transparente

Preferiblemente usar un microondas para fundir la agarosa (sin cubrir con aluminio el vaso) a temperatura alta en 30 segundos. También se pueden realizar pulsos de calentamientos durante 2 minutos agitando el matraz entre pulsos. Verificar que no haya pequeñas partículas claras de agarosa. La solución final debe ser clara y transparente

4. Si se ha producido una evaporación detectable, agregar agua destilada para llevar la solución al volumen original marcado en el matraz o vaso de precipitados en el paso 2. El volumen total debe ser de un mínimo de 230 ml

5. Enfriar la solución de agarosa a 55 °C en un baño de agua. Agitar el matraz o vaso en el baño para facilitar la disipación de calor

6. Preparar alícuotas de 25 ml de la solución de agarosa (55 °C) para cada uno de los diez grupos

PREPARACIÓN DE PLACAS DE OUCHTERLONY

1. Cada grupo necesita 4 placas: 1 placa de carga para practicar y 3 placas experimentales. Usar una pipeta de 5 ml o 10 ml, pipetear cuidadosamente 5 ml de la agarosa líquida (enfriada a 55 °C) en cada placa, girando la placa para cubrir el fondo con agarosa. Repetir con las placas restantes

2. Si la agarosa líquida contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas

3. Permitir que la agarosa se solidifique. Esto tardará aproximadamente 10-15 minutos, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco

4. Si las placas no se van a usar ese día, pueden envolverse con plástico y almacenarse invertidas en la nevera hasta dos semanas

PREPARACIÓN DE POCILLOS PARA LAS MUESTRAS

1. Hacer varias copias de la plantilla (figura inferior) para los grupos de laboratorio

2. Colocar la plantilla debajo de una de las placas para que el patrón esté en el centro de la placa. Las distancias entre los pocillos son importantes. Intentar seguir la plantilla con la mayor precisión posible

3. Cortar los cinco pocillos con el cortador de pocillos (proporcionado en el kit) con un suave movimiento de perforación. Retirar los tapones de agarosa con un palillo de dientes o una espátula de bordes planos

4. Si la colocación del pocillo no es precisa, debe haber suficiente espacio en la placa para volver a cortar los pozos utilizando la plantilla

5. Repite los pasos 2 y 3 con las otras dos placas

CARGA DE LAS MUESTRAS EN LOS POCILLOS

1. Anotar la identificación de cada grupo en la parte superior de la placa antes de cargar las muestras

2. Usando la misma pipeta, llenar los pocillos centrales de las tres placas con 30 microlitros (2 gotas con una pipeta de transferencia) de antisuero (anticuerpo) del tubo A. Los pocillos deben aparecer llenos, pero tener cuidado de no llenar demasiado los pocillos y causar derrame en la superficie de agarosa. Esto puede afectar sus resultados

3. Llenar los pocillos externos con 30 microlitros de antígeno usando una punta de pipeta limpia para cada antígeno de la siguiente manera:

Placa 1:

·         Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)

·         Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B)

·         Pocillo superior derecho: suero entero (tubo B)

·         Pocillo inferior izquierdo: suero entero (tubo B)

·         Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B)

Placa 2:

·         Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)

·         Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B)

·         Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B)

Placa 3:

·         Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)

·         Pocillo superior izquierdo: IgG (tubo D)

·         Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior derecho: IgG (tubo D)

INCUBACIÓN

Colocar las tapas en las placas. Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No se deben invertir las placas. Cubrir la cámara con una envoltura de plástico y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación o la cámara se puede colocar en un horno de incubación a 37 °C.

RESULTADOS

Las líneas de precipitación serán visibles en 24-48 horas a temperatura ambiente. Sostener con cuidado la placa para que las luces superiores (del techo) de la sala brillen a través de ella. Se deben poder ver arcos blancos opacos en cada lado de la placa donde el anticuerpo y el antígeno precipitaron. Se debe hacer un dibujo de los resultados obtenidos.