Práctica 10: Procedimiento de ouchterlony

OBJETIVOS

Introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchterlony

REACTIVOS

·         A Antisuero (Anticuerpo)

·         B Suero total (Antígeno)

·         Albúmina (Antígeno

·         D IgG (Antígeno)

·         E Tampón en polvo

·         1 Agarosa UltraSpec

MATERIAL

·         Tubos Microtest

·         Pipetas de transferencia

·         Plantilla para corte de pocillos (en el protocolo)

·         Cortadores para pocillos (“well cutters”)

·         Placas de Petri

·         Envase de plástico o placa Pyrex

·         Baño de agua

·         Micropipetas automáticas y puntas

·         Baño de agua

·         Espátula o mondadientes

·         Agua destilada

·         Pipetas (5 o 10 ml)

·         Rotulador

·         Microondas

·         Toallas de papel

·         Envoltura o lámina de plástico (film transparente)

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE AGAROSA.

 

1. En un matraz o vaso de precipitados de 500 ml, agregar todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 ml de agua destilada. Agite el matraz o vaso de precipitados para disolver totalmente el polvo

2. Añadir todo el contenido del paquete de Agarosa™ UltraSpec al matraz o vaso de precipitados (3 gr). Agitar la suspensión para dispersar los grumos. Con un rotulador, indicar el nivel de volumen de la solución en el exterior del matraz o vaso de precipitado

3. Se debe calentar (hasta punto de ebullición) la solución para disolver la agarosa. Esto se puede lograr con una placa calefactora. Cubrir el vaso con papel de aluminio. Calentar la mezcla hasta que llegue a punto de ebullición sobre una placa con agitación ocasional. Usar gafas de seguridad y guantes protectores para el calor. Mantener la mezcla con calor hasta que toda la agarosa gelatinosa se disuelva. Durante el calentamiento, retirar ocasionalmente el vaso de precipitados del calor y verificar que no haya partículas pequeñas y claras de agarosa. Continuar calentando con agitación ocasional. La solución final debe ser clara y transparente

Preferiblemente usar un microondas para fundir la agarosa (sin cubrir con aluminio el vaso) a temperatura alta en 30 segundos. También se pueden realizar pulsos de calentamientos durante 2 minutos agitando el matraz entre pulsos. Verificar que no haya pequeñas partículas claras de agarosa. La solución final debe ser clara y transparente

4. Si se ha producido una evaporación detectable, agregar agua destilada para llevar la solución al volumen original marcado en el matraz o vaso de precipitados en el paso 2. El volumen total debe ser de un mínimo de 230 ml

5. Enfriar la solución de agarosa a 55 °C en un baño de agua. Agitar el matraz o vaso en el baño para facilitar la disipación de calor

6. Preparar alícuotas de 25 ml de la solución de agarosa (55 °C) para cada uno de los diez grupos

PREPARACIÓN DE PLACAS DE OUCHTERLONY

1. Cada grupo necesita 4 placas: 1 placa de carga para practicar y 3 placas experimentales. Usar una pipeta de 5 ml o 10 ml, pipetear cuidadosamente 5 ml de la agarosa líquida (enfriada a 55 °C) en cada placa, girando la placa para cubrir el fondo con agarosa. Repetir con las placas restantes

2. Si la agarosa líquida contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas

3. Permitir que la agarosa se solidifique. Esto tardará aproximadamente 10-15 minutos, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco

4. Si las placas no se van a usar ese día, pueden envolverse con plástico y almacenarse invertidas en la nevera hasta dos semanas

PREPARACIÓN DE POCILLOS PARA LAS MUESTRAS

1. Hacer varias copias de la plantilla (figura inferior) para los grupos de laboratorio

2. Colocar la plantilla debajo de una de las placas para que el patrón esté en el centro de la placa. Las distancias entre los pocillos son importantes. Intentar seguir la plantilla con la mayor precisión posible

3. Cortar los cinco pocillos con el cortador de pocillos (proporcionado en el kit) con un suave movimiento de perforación. Retirar los tapones de agarosa con un palillo de dientes o una espátula de bordes planos

4. Si la colocación del pocillo no es precisa, debe haber suficiente espacio en la placa para volver a cortar los pozos utilizando la plantilla

5. Repite los pasos 2 y 3 con las otras dos placas

CARGA DE LAS MUESTRAS EN LOS POCILLOS

1. Anotar la identificación de cada grupo en la parte superior de la placa antes de cargar las muestras

2. Usando la misma pipeta, llenar los pocillos centrales de las tres placas con 30 microlitros (2 gotas con una pipeta de transferencia) de antisuero (anticuerpo) del tubo A. Los pocillos deben aparecer llenos, pero tener cuidado de no llenar demasiado los pocillos y causar derrame en la superficie de agarosa. Esto puede afectar sus resultados

3. Llenar los pocillos externos con 30 microlitros de antígeno usando una punta de pipeta limpia para cada antígeno de la siguiente manera:

Placa 1:

·         Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)

·         Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B)

·         Pocillo superior derecho: suero entero (tubo B)

·         Pocillo inferior izquierdo: suero entero (tubo B)

·         Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B)

Placa 2:

·         Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)

·         Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B)

·         Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B)

Placa 3:

·         Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)

·         Pocillo superior izquierdo: IgG (tubo D)

·         Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C)

·         Pocillo inferior derecho: IgG (tubo D)

INCUBACIÓN

Colocar las tapas en las placas. Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No se deben invertir las placas. Cubrir la cámara con una envoltura de plástico y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación o la cámara se puede colocar en un horno de incubación a 37 °C.

RESULTADOS

Las líneas de precipitación serán visibles en 24-48 horas a temperatura ambiente. Sostener con cuidado la placa para que las luces superiores (del techo) de la sala brillen a través de ella. Se deben poder ver arcos blancos opacos en cada lado de la placa donde el anticuerpo y el antígeno precipitaron. Se debe hacer un dibujo de los resultados obtenidos.

 

Práctica 9: Estreptolisina

OBJETIVO

La estreptolisina (SLO) es un purificado procedente del cultivo de Estreptococos β-hemoliticos. Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativo del título de antiestreptolisina O, por la técnica de inhibición de la hemólisis.

FUNDAMENTO

El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos ant-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir

REACTIVO

Kit para 30 det. macro/250 micro. Contiene:

·         10 x 15 ml. Estreptolisina O liofilizada.

·         Prereducida antes de liofilizar. El producto está estandarizado frente al patrón internacional de la O.M.S. de tal manera que 0,5 ml se combinan con 1 unidad internacional de antiestreptolisina.

Opcionalmente:

·         1 x 100 ml Tampón fosfato isotónico pH 6,5.

·         10 veces concentrado. Diluir con agua desionizada hasta obtener 1 litro de disolución.

REACTIVO DE TRABAJO

Rehidratar el vial de Estreptolisina O, liofilizada con el volumen de agua desionizada indicado en la etiqueta. Mezclar suavemente evitando los movimientos enérgicos que podrían conducir a la oxidación del producto. El olor característico de la disolución es debido a la presencia de un reductor. Se recomienda proceder a la hidratación del vial justo antes de la determinación.

MUESTRA

·         Suero fresco. Mantener en refrigerador a 2º-8ºC, no más de 5 días.

PROCEDIMIENTO

MACROMETODO

·         Suspensión de hematíes: sangre total de conejo, humana del grupo 0 o del propio paciente. Se lavará esta sangre 3 veces por centrifugación a 2000 rpm/3-5 min, descartando el sobrenadante. El último centrifugado será de 15 min. Sangres que tras el cuarto lavado, presenten indicios de hemólisis en el sobrenadante, deberán ser desechadas. Como disolución de lavado se recomienda el tampón de fosfato isotónico pH 6,5. Del paquete globular de la última centrifugación se toman 5 ml que se suspenden con 95 ml de la disolución de tampón de fosfato.

·         Diluciones del suero.

Las siguientes diluciones del suero del paciente se preparan:

A.      0,5 ml de suero à        +4,5 ml de tampón  (1:10)

B.      1,0 ml dil. A    à            +9,0 ml de tampón  (1:100)

C.      2,0 ml dil. B  à           +8,0 ml de tampón  (1:500)

 

Se utiliza una batería de tubos como se indica a continuación y se prepara las diluciones que se especifican:

MICROMETODO

·         Suspensión de hematíes. Procede del mismo modo que en el Macrométodo. Tomar el último paquete globular 3 ml y suspenderlos con 97 ml de disolución de tampón fosfato pH 6,5.

·         Diluciones del suero.

Las siguientes diluciones del suero del paciente se preparan:

A.      0,2 ml suero + 1,8 ml tampón  (1:10)

B.      0,1 ml suero + 2,4 ml tampón  (1:25)

Se dispensan 50 μL de tampón en cada pocillo de dos filas de la placa. (Cada suero precisa de dos filas).

1.       Añadimos 50 μL de la dilución  1:10 al primer pocillo de la fila A.

2.       Añadimos 50 μL de la dilución 1:25 al primer pocillo de la fila B.

3.       A partir del primer pocillo efectuamos sucesivas diluciones con la ayuda de un microdiluidor, por pases de 50μL (dejar el último pocillo de cada fila para control)

4.       Añadimos 25μL de disolución de estreptolisina O rehidratada a todos los pocillos excepto en el último de la fila B

5.       Agitamos suavemente e incubar a 15 min/37ºC

6.       Añadimos 25μL de suspensión de hematíes al 3% a cada pocillo.

7.       Agitamos suavemente e incubar 45 min/37ºC, agitando después de los primeros 15min.

8.       Centrifugamos a 1000-1500 rpm/2 min o dejar sedimentar duran unos 50-60 min a temperatura ambiente.

Controles

·         Hematíes: 25μL tampón + 25μL de suspensión de hematíes 3% (fila B).

·         Estreptolisina O: 25μL de SLO + 25μL de suspensión de hematíes al 3% (fila A).

Práctica 8: Titulación de duetos anti-A y anti-B

OBJETIVO

Determinar la titulación de sueros en contacto con hematíes comerciales.

MATERIAL

·         Tubos de hemólisis.

·         Centrífuga.

·         Baño termostático.

·         Pipetas automáticas.

·         Transiluminador.

·         Microscopio.

REACTIVOS

·         Hematíes comerciales A1 , B (suspensión de hematíes al 2%).

·         Sueros Anti-A, Anti-B y Anti-AB.

MUESTRA

·         Suero

PROCEDIMIENTO

1.       Colocamos en una gradilla una serie de 11 tubos de ensayo por cada suero a probar.

2.       Los marcamos como P, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024...

3.       Agregamos a cada uno de ellos excepto al primero 0,1ml de solución salina o solución salina atemperada (PBS).

4.       Agregamos 0,1ml de suero a probar al tubo P y al tubo 2 únicamente.

5.       Mezclamos perfectamente el contenido del tubo 2 y transferir 0,1 ml de esa disolución al tubo siguiente, repetir este procedimiento hasta el último tubo.

6.       Desechamos 0,1ml del último tubo.

7.       Agregamos 0,1ml de suspensión de hematíes a todos los tubos.

8.       Mezclamos y centrifugamos 25 segundos a 3500 rpm.

9.       Leemos los resultados.

Práctica7:Toxoplasmosis

OBJETIVO

Determinar cualitativamente Ac séricos dirigidos contra Toxoplasma gondii por hemaglutinación indirecta.

MATERIAL

·         Placa microtitter.

·         Micropipeta

·         Centrífuga.

·         Estufa.

REACTIVOS

·         Hematíes sensibilizados y no sensibilizados.

·         Tampón fosfato.

·         Adsorbente.

·         Control +

·         Control -

MUESTRA

·         Suero fresco.

PROCEDIMIENTO

1.       Preparamos una dilución madre del suero a analizar 1/40 (50μl de suero y 1,95ml de tampón fosfato). Con ayuda de una micropipeta, dispensamos 50μl de tampón fosfato en 8 pocillos.

2.       Dispensamos 50μl de disolución madre en el pocillo 1.

3.       Mezclamos con el tampón y transferimos 50μl del pocillo nº1 al 2, del 2 al 3 y así sucesivamente hasta el 6 pocillo, descartando los últimos 50μl.

4.       Dispensar 50μl de la dilución madre de suero en el pocillo 7.

5.       Mezclamos con el tampón y descartamos 50μl. Esta dilución (1/80) constituye el suero control, cuyo papel es detectar las aglutininas naturales anti-ovino que pueden contener ciertos sueros.

6.       Agitamos cuidadosamente las suspensiones de hematíes.

7.       Depositamos 1 gota de hematíes sensibilizados en los primeros 6 pocillos.

8.       Depositamos 1 gota de hematíes no sensibilizados en el 7 pocillo (suero control).

9.       Depositamos 1 gota de hematíes sensibilizados en el 8 pocillo cuyo papel es controlar la validez del tampón y de los hematíes sensibilizados.

10.   Homogeneizamos muy cuidadosamente el contenido de los pocillos.

11.   Dejamos 2 horas inmóvil y al pasar esas 2 horas leemos los resultados.

RESULTADOS

La práctica no salió bien debido a que en el la fila B, al último pozo se le echó un reactivo equivocado